Molecular genetic nga pamaagi sa panukiduki

Sa pagsuhid ug pag-ila sa variants sa DNA gambalay nga gigamit molecular genetic nga pamaagi. Alang sa matag DNA rehiyon, nga Isaysay kini nga rehiyon sa chromosome, gene o allele, ang mga pamaagi lahi. Nagpahiping matag molecular genetic pamaagi naglangkob sa pipila o sa uban pang mga manipulasyon sa RNA ug sa DNA. Ang tanan niini nga mga pamaagi nga gihulagway sa usa ka dakong komplikado, nga walay dili mahimong gidala sa gawas kahimtang sa laboratoryo, ug ang sungkod kinahanglan nga kaayo kwalipikado nga. Kini nga buhat nga gidala sa gawas sa pipila ka yugto.

yugto

Una, RNA o DNA sample nga gipatungha. Dinhi, usa ka molecular genetic nga pamaagi mahimong magamit sa halos sa bisan unsa nga materyal nga: sa usa ka tinulo sa dugo, mga leukocyte, fibroblasts kultura, mucosa (kiskisi), bisan pa ang mga buhok follicles, - DNA mahimo nga nakuha gikan sa bisan unsa sample. Kini mao ang angay sa paggamit sa bisan unsa nga molekula genetic mga pamaagi ug sa ilang mga nagkalain-laing mga kapilian ug dugay inusara DNA gitipigan frozen. Ang ikaduha nga yugto gipahinungod sa panagtigum, panagtingub sa sa gitinguha nga mga tipik (ginansiya) sa DNA, ingon nga kini makatabang sa pagsiguro sa polymerase kadena nga reaksyon sa vitro (sa vitro nga walay kalambigitan sa buhi nga organismo). Ingon sa usa ka resulta, ang mga pinili nga DNA tipik modaghan pinaagi niini nga kadena nga reaksyon, ug ang kantidad sa DNA pagtaas sa literal minilyon sa mga panahon.

Ang ikatulo nga lakang sa molekula mga pamaagi genetic research mao ang gituohan nagpadaghan sa DNA restriction (kini fragmentation, sa nagalubag o pagputol). Pagdili nga gihimo sa electrophoresis sa usa ka polyacrylamide o agarose gel. Kini nga molecular-genetic nga paagi sa pagtuon sa DNA tipik nagtugot sa tanan sa pagkuha sa usa ka pipila ka mga posisyon sa gel. Human niana, ang gel nga pagtratar uban sa ethidium bromide, makahimo sa pagbugkos sa DNA, ang irradiation uban sa ultraviolet nga kahayag, nan kini mao ang posible nga sa pagtuman sa luminescence bahin. Molecular genetic diagnostic mga pamaagi mao ang mga lain-laing ug daghan, apan ang unang duha ka mga lakang nga komon sa tanan. Apan aron sa pag-ila sa DNA tipik, ang gel mahimong kolor nga, ug daghan pang ubang mga kasamtangan nga mga pamaagi.

sakop sa henero nga

Ang labing direkta ug kaylap nga mga pamaagi sa pag-ila mycobacteria mahimong maglakip sa ibabaw molecular genetic DNA pamaagi sa pagkat-on. Niini diwa mao nga, aron sa pag-ila sa mga scan kadena nga materyal sa piho nga mga tipik sa DNA sa pathogens. Molecular genetic diagnostic mga teknik sa wala pa sa usa ka labaw nga hapsay nga paagi sa pag-ila sa mga sakit sama sa TB. Pinaagi sa paggamit sa polymerase kadena nga reaksyon (PCR), nga kamo mahimo nga sigurado nga ang orihinal nga DNA sa pagdugang sa gidaghanon sa mga kopya sa usa ka milyon nga mga panahon, nga mao, adunay ginansiya, ug kini ipakita sa mga resulta. Ang lebel sa pagkasensitibo kaayo taas nga - labaw pa kay sa kasiyaman ug lima ka porsyento, nga mao ang nag-unang pagpahimulos sa niini nga paagi.

Ang uban sa mga molecular-genetic pamaagi sa research sa pagka-epektibo sa abot daghang kopya sa literal midoble, kay sa niini nga kaso sa pagdihon sample nagpakita sa usa ka piho nga oligonucleotide han-ay misaka ngadto sa usa ka gatus ug unom ka mga panahon. Bisan ang kultura panghiling sa TB sa respiratory nga sistema kamahinungdanon ipaubos sa iyang pagkasensitibo. Kini mao ang hinungdan ngano nga sa modernong medisina gibase sa molecular genetic pamaagi sa diagnosis sa tuberculosis. Ang usa ka gihulagway nga pamaagi mao ang epektibo ilabi na sa diha nga pagpakig-angot sa pathogens sa hatag-as nga antigenic pagkamabalhinon, pagtino nga ang laing paagi mao ang daghan nga mas lisud - nagkinahanglan sa espesyal nga nutrient media ug sa pag-ugmad sa hataas nga panahon. Biokemikal ug molecular genetic mga pamaagi pagmugna lahi kaayo nga epekto sa mga resulta.

panghiling sa tuberculosis

Marshall PCR diagnosis sa tuberculosis labing sagad sa paggamit sa mga han-ay DNA nga piho nga alang sa tanan nga upat ka mga matang sa mga sakit. Aron makab-ot kini nga tumong sa kasagaran sa paggamit sa primers nga makamatikod han-ay ANG elemento (ANG-986, ANG-6110), ingon niini nga mga elemento timaan sa kaayo tiglalin sa henero nga Mycobacterium tuberculosis ug sa kanunay karon daghang kopya sa genome. Usab mahimong gidala sa gawas sa DNA pagkuha gikan sa lunsay nga kultura ug Clinical (sputum sa mga pasyente) sa bisan unsa nga lain nga mga angay nga pamaagi. Pananglitan, may Boom nga pamaagi diin ang mga lysis buffer gigamit base sa guanidine thiocyanate ug silica ingon sa carrier DNA. Ang gidaghanon sa mga pasyente nga lahi kabus bacteriological pagdugang sa matag tuig, ug busa sa clinical praktis nga malig-on sa usa ka bug-os nga lain-laing mga ang-ang sa organisasyon: molecular-genetic nga paagi sa pagtuon sa DNA nga pagdula sa usa ka mayor nga papel sa panghiling.

Apan, kita kinahanglan gayud nga angkonon nga kini dili nga walay drawbacks. Ang PCR pamaagi mao ang paggamit sa sagad nagdala sa usa ka dako nga gidaghanon sa mga bakak nga-positibo nga resulta, ug ang rason mao ang dili lamang sa teknikal nga mga sayop, apan usab sa mga bahin sa mga pamaagi sa iyang kaugalingon. Dugang pa, sa paggamit kini nga paagi sa panghiling sa pagtino sa viability sa mga mycobacteria, nga giila, kini mao lamang nga dili mahimo. Apan kini nga Disbentaha dili mao ang labing importante. Molecular genetic pamaagi sa PCR diagnostics nagkinahanglan sa risgo sa kontaminasyon sa mycobacterial DNA. Certification mga kinahanglanon alang niini nga rason nga tungod sa PCR laboratoryo gidisenyo lamang malisud, nagkinahanglan sila tulo ka managlahi nga pasikaran. PCR teknolohiya mao ang moderno ug kaayo komplikado, nagkinahanglan kini sa paggamit sa tukma nga ekipo ug hatag-as nga nabansay-sa-personnel.

bacterioscopy

Sa diha nga ang panghiling resulta sa pagtuki kinahanglan itandi sa uban nga mga data: clinical examination, radiography, smear microscopy, tanom ug bisan sa tubag sa usa ka piho nga pagtambal mao ang importante kaayo. Sa niini nga serye, ang PCR mga pagtuon mao ang usa sa mga sangkap sa lamang. Makamatikod ang pathogen sa sayo sa panghiling mahimong ang yano ug labing dali nga mga pamaagi - bacteriological.

Adunay gigamit sa usa ka kahayag mikroskopyo (pagkolor Ziehl-Neelsen) ug fluorescent (Koloranan nga fluorochromes). bentaha mao ang speed smear sa mga resulta. Apan ang drawback haom giisip sa mga limitado nga kapasidad tungod sa ubos nga sensitivity. Apan, kini nga pamaagi gihatag KINSA rekomendasyon ingon nga ang labing ekonomikanhon ug ang yuta sa pagmatikod tuberculosis mga pasyente. Detection sa mycobacteria bacteriological pamaagi adunay bili panagna ug gibanabana kantitatibong bakterya eliminasyon. Daghan nga mas masaligon sa pag-atubang sa niini molecular genetic mga pamaagi research sa tuberculosis.

kultura

Mas maayo nga detection sa mycobacteria sa pag-ila sa kultura nga mga pagtuon. Pagpugas pathological nga materyal kini gihimo ngadto sa medium itlog: Mordovsky, Finn II, LJ, ug sa mga sama. Benchmarks sa pagsukol sa mycobacteria sa tambal ug dili-direkta nga ebidensya sa ka epektibo sa usa ka gidaghanon sa mga mycobacteria ug sa ilang mga kolonya sa vitro, kon ang apply pamaagi sa research kultura. Aron sa pagdugang sa porsiyento sa-inusara sa mycobacteria inoculation sa pathological nga materyal nga gihimo sa daghang mga dapit.

Tagboanan sa mga panginahanglan sa daghang mga kultura, pathogen lakip na ang grant ug pluwido. Gigamit sa sistema niini ug automated metering matang VANTES pagtubo. Tanom kinahanglan nga gihimo sa paglumlum alang sa sa sa sa pito ka ngadto sa walo ka semana. Pinaagi niini nga panahon ang mga tanom uban sa kakulang sa pagtubo mahimong giisip nga negatibo. Ang labing epektibo nga paagi sa pag-ila Mycobacterium tuberculosis hunahunaa biological nga sample: diagnostic materyal nga motakod sa guinea baboy, nga hilabihan delikado sa TB.

Ang ubang mga numero

Makapaikag nga kapatagan sa pagtuon, nga giablihan sa PCR diagnostics mao ang pagtuon sa M. tuberculosis - tinago impeksyon. Ang modernong konsepto sa TB impeksyon nagsugyot nga gikan sa usa ka gatus ka tawo nga diha sa kontak uban sa M. tesis, kasiyaman-tingali nga natakdan, apan lamang sa napulo ka kanila mga aktibo nga sakit ang naugmad. Ang uban adunay TB resistensya, ug tungod kay kasiyaman porsiyento sa mga kaso sa impeksyon nagpabilin tinago. Namatikdan sa usa ka sumbanan nakatabang kini sa usa ka molecular genetic nga pamaagi.

Henetiko-ingon nga kalim-an ug lima ka porsyento sa mga kansang mga tanom pathological nga materyal ang mga negatibo, ug kawaloan porsiyento sa mga tawo nga nataptan sa M. tuberculosis, apan nga nagapaagay sa walay radiographic mga timailhan sa sakit, PCR positibo mga tubag nga nadawat. Kini mao ang usa ka genetic diagnostic nga pamaagi nakatabang sa pag-ila sa mga pasyente sa peligro sa PCR mga pagtuon, sa mga resulta sa ilang mga analisar (microscopy ug kultura) ang negatibo, ug subclinical impeksyon M. tuberculosis mao karon.

modernong panukiduki sa

Ang Russian Federation ug bacteriological laboratoryo sa paggamit sa usa ka Accelerated pamaagi sa bug-os nga konsentrasyon: nitrate reductase kalihokan sa mycobacteria gisulayan sa Griess reagent. Anti-TB centers sa paggamit sa usa ka paagi nga nagtugot sa pagtino drug pagbatok. Kini nga seeding sa liquid media, diin automated radiometric ug fluorescent accounting nga sistema sa pagtubo sa mycobacteria. Ang maong usa ka pagtuki ang gibuhat sa madali - ngadto sa duha ka semana.

Sa pagkakaron, ang bag-ong mga pamaagi nga naugmad: drug pagsukol sa mycobacteria gisukod sa lebel genotype. Pagtuon sa mga molekula nga mekanismo sa pagbatok gene ug nagpakita sa atubangan sa mycobacteria. Kini nga mga gene nalangkit sa pagbatok sa pipila ka droga. Pananglitan, kasA gene, inhA, katG resistant sa isoniazid, rpoB gene - rifampicin 16Sp RNA gene ug rpsL - streptomycin, emb1 - sa ethambutol, gyrA - sa usa ka fluoroquinolone ug sa ingon sa.

mutasyon

Ang modernong diagnosis kamahinungdanon nagdugang sa mga molecular-genetic nga lebel nga pamaagi alang sa pagtuon sa DNA ug gitugotan sa pagtuman sa dako nga-scale nga mga pagtuon sa mga mutasyon sa ilang tanan nga mga kolor. Karon kita nahibalo nga ang labing komon nga mutasyon sa 516, 526 ug 531 codons sa rpoB gene, ug giila sa pagbatok sa mga nagkalain-laing mga drugas. Adunay usa ka bug-os nga-laing mga pamaagi alang sa pagtayp sa mycobacteria paggamit dili lamang sa tradisyonal nga mga pamaagi - biochemical, biological ug sa kultura, apan usab sa kaylap nga gigamit sa modernong molecular genetic teknik. Na adunay igo ug paghatag sa husto nga pamaagi panghiling alang sa detection sa monogenic mga sakit. Sila base sa DNA mga pagtuon sa eksaktong dapit sa usa ka partikular nga gene. Kini mao ang kasagaran usa ka komplikado nga proseso, sa panahon nga nagaut-ut ug mahal, apan ang data nga gihatag sa molecular genetic pagtuki, mao ang daghan nga mas tukma ug matulon-anon kay sa data sa tanan nga uban nga mga analisar.

Kini dugay na nga nailhan nga ang DNA wala mag-usab sa tibuok nga kinabuhi sa mga organismo nga kini anaa sa bisan unsa nga nucleated mga selula sa odnakova, ug kini kini nga posible nga sa pagkuha sa pagtuki sa hingpit ang tanan nga mga selula sa lawas, sa bisan unsa nga yugto sa ontogeny. Ang naguba nga gene mahimong nakadipara sa atubangan sa mga dagway sa mga una nga mga sintomas sa bug-os-scale clinical sakit, ingon man usab sa himsog nga heterozygous mga tawo, apan may usa ka mutasyon sa gene. Molecular genetic napanunod nga sakit diagnostic mga pamaagi sa pagtugot sa pagpadayag sa iyang (direkta nga paagi, DNA-diagnostics), ingon man sa pag-analisar sa segregation sa sakit diha sa mga pamilya uban sa marker loci DNA (genetic polymorphisms), nga suod nga nalambigit sa usa ka nadaot nga gene (ie, ang dili direkta nga pamaagi sa DNA-diagnostics). Direkta o dili direkta - sa bisan unsa nga DNA diagnostics gibase sa mga pamaagi sa pag-ila sa usa ka hugot nga gihubit nga bahin sa tawhanong DNA.

direkta nga mga pamaagi

Direct pamaagi sa DNA diagnosis mao ang sa diha nga ang hinungdan gene napanunod nga sakit nailhan, ingon man nailhan, ug matang sa iyang mga mutasyon. Pananglitan, ang usa ka angay nga direkta nga mga pamaagi sa usa ka gidaghanon sa mga sakit. Kini ni Huntington chorea (extension CTG-misubli), phenylketonuria (R408W), dunay cystic fibrosis (delF508, mga mayor nga mutasyon) ug sa mga sama. Ang nag-unang pagpahimulos sa mga direkta nga pamaagi mao ang usa ka bug-os nga gipanag-iya diagnostic tukma, ug walay panginahanglan sa pagbuhat sa usa ka DNA pagtuki sa mga uban nga mga pamilya. Kon ang usa ka mutasyon sa katugbang nga gene makaplagan, sa tukma kini nagtugot mouyon sa usa ka panghiling sa kaliwat, genotype determinasyon alang sa uban nga mga nabug-atan sa pamilya.

Laing bentaha sa direkta nga diagnosis giisip sa pag-ila sa usa ka heterozygous carrier sa dili maayo nga mutasyon gikan sa mga paryente ug mga ginikanan nga namatay gikan sa sakit. Kini mao ang tinuod nga ilabi na alang sa mga sakit autosomal sa motumaw. Disadvantages sa direkta nga mga pamaagi usab sa anaa. Aron sa paggamit sa kanila, kamo kinahanglan nga masayud kon localize sa mga abnormal nga gene, exon-intron istruktura sa iyang kolor ug sa mutasyon niini. Dili ang tanan nga monogenic mga sakit karon nakadawat sa maong impormasyon. Informativeness direkta nga mga pamaagi dili isipon nga bug-os, tungod kay sa usa ug sa mao usab nga gene makabaton sa usa ka dako nga gidaghanon sa pathological mutasyon nga maoy hinungdan sa pagpalambo sa sumbanon nga mga sakit.

dili direkta nga mga pamaagi

Dili-direkta nga mga pamaagi sa DNA diagnostics gigamit sa tanan, sa ubang mga kaso, kon ang naguba gene dili giila, apan lamang chromosomally, o kon ang linya panghiling wala sa paghatag sa mga resulta (kini mahitabo, kon ang gene complex molecular nga organisasyon o sa usa ka dako nga gidak-on, kon adunay usa ka daghan pathological mutasyon). Dili direkta nga mga pamaagi nga gihimo segregation pagtuki sa mga polymorphic puntos sa allelic pamilya. Puntos nga makita sa sama nga chromosomal rehiyon o locus ang pag-ayo nga nalambigit sa sa sakit ug nagrepresentar sa materyales nga nawala o insertions, punto ilis, misubli, ug ang ilang polymorphism mao ang tungod sa lain-laing mga kantidad sa mga selula sa block.

Labing sayon alang sa dili-direkta panghiling giisip microsatellite ug minisatellite polymorphisms, nga kaylap nga-apod-apod sa genome sa tawo. ang ilang mga bili nga gipahayag diha sa taas nga sulod nga impormasyon, kon kadaot sa sa genetic nga gilay-on sa taliwala sa mga marker ug sa gene dili kaayo dako. Sa ulahing mga kaso, ang mga pagbana-bana tukma determinado sa usa ka dako nga gidak-on sa frequency sa recombination sa taliwala sa mga polymorphic marker ug sa kadaot. Dili direkta nga diagnostic nga mga pamaagi sa paghatag usab sa mandatory preliminary lakang sa allele frequency sa mga analisar populasyon pagtuon sa taliwala sa mga pasyente ug mga tagdala sa mga mutasyon, plus sa panginahanglan sa pagtino sa kalagmitan sa recombination sa nonequilibrium ug pagpilit puntos ug mutant alleles.

sa uban nga mga pamaagi sa

Short bahin sa RNA o DNA, ingon man sa single gene Napanglantawan ubos sa microscopic pagtuon dili mahimo, busa, aron sa pag-ila sa mutasyon gikinahanglan sa molecular genetic diagnosis. Adunay usa ka "Human Genome Project", ingon man sa uban nga mga kauswagan sa molekula genetics sa hilabihan gayud gipalapdan sa posibilidad sa mga panghiling sa napanunod nga mga sakit - ang duha pre ug kaha post natal nga. Kini nga mga paagi nga sa paghatag og sayo nga detection ug sa paghimo sa usa ka panagna poly- ug monogenic mga sakit, kansang debut mahitabo sa pagkahamtong. Ikasubo, tungod sa teknikal nga kapabilidad sa molecular genetic mga pagtuon usahay sa unahan sa ethical utlanan nga gibutang sa relasyon ngadto sa panulondon, ilabi na sa dihang ang diagnosis mao ang sa pagkabatan-on ug pagkabata.

Structural ug gidaghanon chromosomal abnormalidad mao ang labing komon nga hinungdan sa sakit ug sa kanser, ug sa daghan nga mga malformations. Chromosomal pagtipas kinahanglan nga giila, nga mao ang importante alang sa pamilya pagtambag - sa pagtimbang-timbang sa forecast, uban sa reproductive risgo sa umaabot nga pagmabdos. Chromosome pagtuki mao ang "bulawan nga sumbanan" sa genetic diagnosis, apan kini mao ang limitado. Lamang ang mga pamaagi sa molecular genetic pagtuki mahimo sa labaw pa, tungod kay gigamit didto sa cloning teknolohiya base fluorescent label makahimo sa ilang hataas nga pagkasensitibo sa pag-ila sa malalangon nga mga kausaban chromosomal nga imposible sa pag-ila klasikal cytogenetic mga pagtuon. Kini nga mga teknik nga mas pagpalapad sa atong diagnostic kapabilidad, sa diha nga gisusi, mga anak uban sa developmental kakulangan, mental utok, uban sa daghan pang ubang mga sumbanon nga mga sakit.

findings

Kini mao ang mahinungdanon kaayo alang sa katawhan mao ang mga gene gambalay ug function sa kahibalo, matang sa pagkamabalhinon, ang abilidad sa pag-ila sumbanon nga mga sakit nga nahitabo sa kalambigitan sa mga kalamboan sa molekula genetics. mga pamaagi niini nga nagtumong sa sa pagtuon sa DNA molekula - ug sa diha nga kini mao ang normal, ug sa diha nga kini naguba. Pagpangandam sa deoxyribonucleic acid han-ay sa mga nucleotides (DNA) mihatag sa yugto gikan sa pagdawat sa mga sampol sa pag-ila tagsa-tagsa nga mga tipik. Inusara sa genomic DNA gikan sa mga selula, pagdili (paggisi), ginansiya (cloning), sa electrophoresis sa mga tipik (pagbulag sa ilang electric sugo ug molecular gibug-aton pinaagi sa agarose gel). Pag-ila sa mga piho nga mga tipik nga nahimutang sa ibabaw sa nawong sa usa ka magkalahi sa labud.

Unya pagkuha sa buhat sa espesyal nga mga pagsala, nga pinaagi niini moagi sa matag tipik Hybridization sa clone DNA tipik o artipisyal nga radioactive imbestigasyon mao ang usa ka control, nga mahimong sama sa matag pagsulay sample. Kon mag-usab sa kaninyo sa posisyon o gitas-on kon itandi sa imbestigasyon, kon ang usa ka bag-o nga tipik o nahanaw - ang tanan nga kini nagpasabot nga ang mga analisar gene nga miagi pagusob sa han-ay nucleotide. Adunay walo ka mga nag-unang mga pamaagi sa molecular genetic mga pagtuon: serye (determinasyon sa DNA ay), polymerase kadena nga reaksyon (pagsaka sa gidaghanon sa mga han-ay), ang pag-andam sa primers nailhan gene, DNA sa cloning, produksyon sa mga artipisyal molekula nga nakuha protina tungod sa artipisyal molekula, pagmugna sa usa ka bug-os nga set (koleksyon librarya) clone tipik nga nakuha pinaagi sa paggamit sa restriction.